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Western Blot

實驗目的:檢測組織或細胞中特定目的蛋白的含量。

實驗原理:將蛋白樣本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離,再轉移到雜交膜上,然后通過一抗/二抗復合物對靶蛋白進行特異性檢測的方法。其中的步驟包括蛋白樣本提取制備,蛋白定量,電泳,轉膜與顯色。
實驗材料:
試劑:蛋白(全/核/膜/胞漿)提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、SDS凝膠電泳上樣緩沖液、電泳緩沖液、封閉液、一抗、二抗、ECL發光液、顯影液、定影液。
儀器:勻漿器、紫外分光光度計、bio-rad電泳儀、恒溫箱。
實驗內容與方法:
1、 蛋白提取:根據需要測定的目的蛋白主要來源(胞漿、胞核或者全蛋白),區分組織提取或者細胞提取,選取相應的試劑盒。
2、 蛋白定量:bradford法、BCA法或lowery法測定出所提取的蛋白含量。
3、 蛋白變性:5×電泳上樣緩沖液,煮沸5~10分鐘。
4、 凝膠電泳:垂直電泳分離出目的蛋白條帶。
5、 轉膜:將SDS丙烯酰胺中的蛋白通過水平電泳的方式轉移到PVDF或者NC膜上。
6、 免疫反應:目的蛋白分別與相應的一抗、二抗結合。
7、 顯色反應:通過化學發光法將蛋白條帶顯影至膠片上。
客戶提供實驗信息:
1、 實驗信息(客戶提供): 
        樣本來源: 細胞 種屬來源__________  或  組織 組織來源_________
        樣本數量:__________       檢測蛋白信息:目的蛋白名稱_______________ 蛋白分子量_________ 
        主要表達部位(選填)_______________________       一抗信息:抗體名稱________________________ 種屬來源__________  
        購買公司______________     推薦工作濃度(選填)_________

2、實驗材料提供:

   (1)樣本材料:

        新鮮或冷凍細胞不少于106個,新鮮或冷凍組織樣本不少于50 mg。

        已提取的蛋白樣品蛋白含量不低于0.1ug/ul。

   (2)試劑:蛋白提取與定量可根據客戶要求選用特定試劑盒,如客戶不提供

試劑盒且無特別要求,則選用凱基公司相應試劑盒產品。一抗二抗反應所用抗體客戶自備,凱基也可以提供抗體代訂服務。

服務周期:(2到8周,根據樣本數量而定)

結果提交:提交實驗報告書(包括實驗材料、試劑、儀器、實驗過程方法、結果及分析)、原始數據、圖片,文本或電子版。

 

實驗范例

   

小鼠骨骼肌組織中myoglobin蛋白電泳條帶

 

beta-actin內參條帶

灰度分析

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