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普通RT-PCR檢測

實驗目的:目的基因表達的相對定量。

實驗原理:利用反轉錄酶,把mRNA反轉錄生成 cDNA,再以cDNA為模板進行PCR擴增,即RT-PCRRT-PCRRNA的質量要求較低,操作簡便,它是在轉錄水平上檢測基因時空表達的常用方法。

實驗儀器:Eppendorf Centrifuge5804RUV-visible SpectrophotometerBIO-RAD Gel DocTM XRMultitene TC9600-G-230V LabNet

實驗內容與方法:

1. 查找基因序列或相關參考文獻,設計或查找特異性的引物,并化學合成引物;

2. 提取樣品總RNA,分光光度法測定總RNA含量,電泳鑒定總RNA完整性;

3. 根據基因屬性進行反轉錄,得到cDNA模板;

4. 使用1中合成的引物進行PCR預實驗與正式實驗;

5. 結果分析,提交實驗報告。

實驗信息(客戶提供):

1. 基因信息     

待測樣品種屬:                                                        

基因全稱與ID                                                       

備注說明:                                                             

2. 實驗材料:

1)樣本材料;

2)試劑材料。

服務周期:2周至8周(具體視樣品數而定)。

結果提交:提交實驗報告書(包括實驗材料、試劑、儀器、實驗過程方法、結果及分析)、原始數據、圖片,文本或電子版。

實驗范例:RT-PCR法檢測基因1/基因2基因的表達

1. 引物設計與合成

內參  primer (527bp):

F: 5’-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3’

R: 5’ -CGTGAGAAGGTCGGAAGGAA -3’

基因1  primer (320bp):

F:5’ -CTGAAGAGCGTGAAGGTTGGA-3’

R:5’ -AAGGATGTGGAGGGAGATGAGT-3’

基因2  primer(600bp):

F:5’- AAATTAATCATATGTGCAGCTGCTCCCCGGTGCAC-3’

R:5’ -GCTTAYGGGTCCTCGATGTC-3’

2.  RNA提取與質量檢測

RNA的濃度=OD260×稀釋倍數×0.04μg/μLOD260/280 1.82.1視為抽提的RNA的純度很高;總RNA瓊脂糖凝膠電泳28S18S5S三條帶較為完整。

3. 基因1/基因2電泳圖

4.基因1/基因2灰度分析

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